Le diagnostic repose sur la mise en évidence des spores dans les prélèvements biologiques. Les spores sont ovoïdes ; leur recherche dans les selles est difficile compte tenu de leur très petite taille (1 μm à 3 μm suivant les espèces). Elle nécessite impérativement l’utilisation de techniques de coloration : soit par un composé fluorescent colorant la paroi des spores (Uvitex 2B, par exemple), soit par le trichrome de Weber qui colore les spores en rose (figures 3.9 et 3.10). Les microsporidies peuvent aussi être mises en évidence sur des biopsies digestives (microsporidioses intestinales) ou d’autres tissus (infection à Encephalitozoon).
L’identification d’espèce repose sur la microscopie électronique et, surtout, sur l’amplification d’ADN par PCR ou l’immunomarquage. Il est important de différencier Enterocytozoon bieneusi des espèces du genre Encephalitozoon car le choix du traitement est dépendant de l’espèce en cause.