La mise en évidence des trypanosomes dans le sang est possible en phase aiguë à frais, sur frottis et goutte épaisse colorés par le MGG. Plus sensible, une centrifugation en tube capillaire hépariné est très utilisée sur le terrain. Les trypanosomes, très mobiles, sont retrouvés à l'interface hématies-plasma (micro-hématocrite). T. cruzi peut être retrouvé dans le liquide cérébrospinal, associé ou non à une symptomatologie neurologique.
Passés les deux ou trois premiers mois de l'infection, la parasitémie devient indétectable par les moyens précités. Trois techniques peuvent alors être utilisées : l'amplification génomique par PCR et, de moins en moins pratiquées, les deux méthodes historiques, culture du sang sur milieu spécifique et xénodiagnostic (« culture in vivo » obtenue en faisant piquer un patient suspect par des triatomes non infestés).
Dans son rapport de 2002, l'OMS recommande, pour la confirmation d'un diagnostic clinique, l'utilisation de deux techniques sérologiques de principe différent, en pratique IFI et ELISA. En transfusion sanguine, le dépistage se fait par une technique ELISA seule. Après traitement, la sérologie va rester positive pendant des années, sauf pour les cas congénitaux traités en néonatal pour lesquels la séronégativation à un an est le critère de guérison.