La qualité des prélèvements conditionne la qualité de l’étude anatomopathologique. Le médecin préleveur et prescripteur a une responsabilité dans l’acte anatomopathologique en s’assurant de la bonne réalisation technique du prélèvement et de son acheminement dans de bonnes conditions au laboratoire (dans des délais brefs, en respectant les règles de fixation, accompagné d’une demande d’examen correctement renseignée).
Enregistrement
Lorsqu’un prélèvement parvient au laboratoire, il est enregistré et reçoit un numéro d’identification unique. Celui-ci sera retranscrit sur les blocs et les lames, qui seront examinées au microscope après le traitement technique du prélèvement. Chaque prélèvement doit être accompagné d’une fiche de renseignements remplie par le médecin prescripteur qui doit mentionner :
Étalement des cellules sur des lames de verre
L’étalement est fait par le préleveur lors des cytoponctions d’organes, des frottis, écouvillonnage, brossages ou appositions. Ce geste simple doit être bien maîtrisé pour éviter un écrasement des cellules, ou des amas, en plusieurs couches peu interprétables (figure 1.4).
Cytocentrifugation sur lame de verre
Le liquide (naturel, ou d’épanchement, ou de lavage) est acheminé au laboratoire où il est centrifugé directement sur une lame de verre, sous forme de pastille (figure 1.5).
Fixation des étalements
Elle se fait soit par simple séchage à l’air pour la coloration de May-Grünwald-Giemsa (figure 1.6),
soit par immersion dans l’alcool-éther, ou par application d’un aérosol de laque fixante pour les colorations de Harris-Schorr, ou de Papanicolaou (frottis cervico-utérins notamment [figure 1.7]).
Afin d’éviter l’altération des cellules par autolyse, la fixation, la cytocentrifugation et la coloration doivent être effectuées rapidement après l’obtention du prélèvement :
En cas de besoin (par exemple, recueil d’un liquide en dehors des heures d’ouverture d’un laboratoire) un liquide peut être provisoirement stocké dans un réfrigérateur à +4 °C.
Étalement des cellules en monocouche
Cette technique moins répandue consiste à recueillir les cellules par ponction (séreuse, organe plein…), ou par frottis (col utérin) et à les transmettre au laboratoire dans un liquide conservateur. Les cellules présentes dans le flacon du fixateur sont ensuite remises en suspension et éventuellement soumises à une dispersion par gradient de densité. Ensuite on effectue un processus de concentration (par filtration et/ou centrifugation). Enfin, les cellules sont transférées en couche mince sur une lame et sur une pastille de taille déterminée.
L’analyse d’un liquide peut également se faire après fixation et inclusion en paraffine d’un culot de centrifugation, qui est alors effectué de la même façon qu’un prélèvement tissulaire.
La technique de prise en charge d’un prélèvement cytologique étant rapide (environ une heure), un résultat urgent peut être donné au médecin prescripteur de l’examen le jour même du prélèvement. Des colorations spéciales et des réactions immunocytochimiques peuvent également être effectuées, à condition de disposer du nombre de lames nécessaires (d’où l’importance des renseignements cliniques fournis à la réception du prélèvement).
Un examen cytopathologique fournit des renseignements souvent partiels, voire sans certitude. Par exemple, les anomalies cytoplasmiques et nucléaires observées dans des cellules cancéreuses, peuvent être difficiles à distinguer de modifications cellulaires induites par des phénomènes inflammatoires ou régénératifs. En outre, lors de l’étude de cellules isolées, des critères importants du diagnostic d’un cancer tels que l’architecture du tissu néoplasique et ses relations avec le tissu sain ne sont pas analysables. L’examen cytopathologique est le plus souvent un examen de dépistage ou d’orientation diagnostique. Un contrôle par biopsie peut être nécessaire avant toute thérapeutique.
La technique de base comporte plusieurs étapes : la fixation, l’inclusion en paraffine, la confection de coupes et leur coloration. Avant la fixation, il est possible d’effectuer sur le tissu frais des appositions sur lames pour une étude cytopathologique, et des prélèvements pour des techniques particulières :
En ce qui concerne les pièces opératoires, une étape d’analyse macroscopique est indispensable, avant (idéalement) ou après la fixation de la pièce.
Étude macroscopique
L’examen macroscopique détaillé est une partie essentielle de l’étude d’une pièce opératoire : la pièce est examinée, mesurée, pesée, palpée puis disséquée (figure 1.8).
.jpg "Figure 1.8 : Examen macroscopique d’une pièce opératoire")
Chaque lésion est repérée sur un schéma et éventuellement photographiée. Ces constatations sont confrontées aux documents cliniques et/ou radiologiques, ce qui souligne l’importance des renseignements écrits fournis par le médecin clinicien. En cas de pièces opératoires complexes (exérèse monobloc de plusieurs organes, ou pièce de résection selon une méthode non conventionnelle), le chirurgien devra adresser la pièce avec des indications de repérage topographique. Il peut être utile de marquer les berges d’une pièce de résection de tumeur avec une encre indélébile : ceci ne nuit pas à l’étude histologique et permet d’apprécier exactement la distance entre la tumeur et la limite chirurgicale de la pièce (figure 1.9).
L’examen macroscopique donne des indications pour le pronostic de la maladie (notamment la taille et la localisation d’un cancer) et il permet de sélectionner les territoires à prélever pour l’étude microscopique : zones lésées, zones d’aspect macroscopique sain et limites d’exérèse.
Après le choix des prélèvements destinés à l’analyse microscopique, les restes de la pièce opératoire sont conservés pendant quelques jours ou semaines afin de pouvoir en cas de nécessité effectuer des prélèvements complémentaires.
Fixation
La fixation est indispensable pour conserver la morphologie cellulaire, elle doit être immédiate ou au moins très rapidement débutée après l’obtention du prélèvement. Toute fixation défectueuse rend l’étude anatomopathologique difficile voire impossible (dessiccation et/ou autolyse du tissu).
Si le laboratoire est situé à proximité immédiate du lieu de prélèvement, celui-ci peut être acheminé rapidement (moins d’une heure) et confié à l’anatomopathologiste qui choisira les conditions de fixation les plus adaptées. Sinon, la fixation doit être effectuée par le médecin préleveur.
Trois précautions doivent être prises :
La durée de la fixation dépend de la taille du prélèvement : au minimum 2 à 5 heures pour une biopsie et 48 heures pour une pièce opératoire.
Nature du fixateur : le fixateur le plus habituellement utilisé est le formol à 10 % tamponné. Pour les biopsies de petites tailles, des fixateurs à base d’alcool peuvent être utilisés (fixation encore plus rapide, mais effet délétère sur certains antigènes, ce qui peut nuire à des techniques particulières d’immunohistochimie).
Cas particuliers des tissus calcifiés : les prélèvements calcifiés (os, certaines tumeurs) doivent être sciés, puis fixés, puis plongés dans une solution décalcifiante (acide) avant d’être inclus dans la paraffine, ce qui rallonge la durée de la technique.
Imprégnation et inclusion
Les prélèvements ayant achevé leur fixation sont déposés dans des cassettes en plastique, directement s’il s’agit de biopsies ou, s’il s’agit de pièces opératoires, après l’étape d’examen macroscopique au cours de laquelle sont prélevés des fragments de petite taille (en moyenne 2 x 0,3 cm). Puis les tissus contenus dans les cassettes sont déshydratés par passage dans des alcools, l’alcool est éliminé par des solvants (xylène), puis la paraffine liquide à 56 °C imprègne les tissus et est refroidie. Ces étapes sont automatisées dans des appareils à inclusion. L’étape finale de l’inclusion est manuelle et consiste à réorienter convenablement le fragment tissulaire dans le sens de la coupe dans un moule de paraffine (figure 1.10).
Coupes et colorations
Le bloc solide de paraffine contenant le tissu est coupé grâce à un microtome, les coupes de 3 à 5 microns d’épaisseur sont étalées sur des lames (figure 1.11).
Après dissolution de la paraffine, puis réhydratation, le tissu est coloré. La coloration usuelle associe un colorant basique nucléaire (hématéine, hématoxyline) et un colorant acide cytoplasmique (éosine, érythrosine, ou phloxine). On y ajoute souvent du safran qui se fixe sur le collagène (figure 1.12).
La coupe colorée est protégée par une lamelle de verre collée, ou par un film plastique transparent (figure 1.13). Elle est alors prête à être analysée au microscope par un médecin anatomopathologiste.
