3  -  Principes des méthodes diagnostiques


Le diagnostic repose sur l’association de critères :

  • cliniques ;
  • immunologiques : recherche d’autoanticorps dans le sérum par immunofluorescence indirecte ;
  • anatomopathologiques, comprenant :
    • un prélèvement cytologique (« cytodiagnostic de Tzanck »), optionnel,
    • un prélèvement biopsique sur une bulle récente ou intacte, en périphérie du décollement, fixé pour examen histologique classique,
    • un prélèvement biopsique en peau péribulleuse, sans fixation, congelé ou mis dans un milieu de transport (liquide de Michel) avec transport immédiat vers le laboratoire d’anatomie pathologique pour examen en immunofluorescence directe.

N.B : la recherche d’autoanticorps dans le sérum se fait par immunofluorescence indirecte, mais ce n’est pas un examen anatomopathologique (utilisation de coupes de peau normale animale dont les caractéristiques moléculaires sont similaires à la peau humaine pour rechercher les autoanticorps dans le sérum du patient) (cf. figure 3).

3 . 1  -  Cytodiagnostic


Raclage du fond de la bulle, étalement direct sur une lame.

La lame est adressée au service d’anatomie pathologique et sera colorée (May-Grünwald-Giemsa, MGG).

C’est une méthode très rapide. Cette technique permet de voir des cellules acantholytiques dans le pemphigus (kératinocytes détachés les uns des autres, de forme arrondie) (figure 2) ou des modifications liées à des virus (effet cytopathogène viral herpétique par exemple).

Figure 2 : Examen cytologique de produit de grattage d’une bulle récente (cytodiagnostic de Tzank) de pemphigus
On trouve un matériel hémorragique avec de nombreuses hématies et, au centre, un kératinocyte acantholytique, arrondi, avec une pâleur périnucléaire du cytoplasme.

3 . 2  -  Examen histologique


Examen histologique standard après fixation.

3 . 3  -  Examen d’immunofluorescence cutanée directe sur une biopsie cutanée congelée


L’immunofluorescence cutanée directe a pour objectif la détection des immunoglobulines (autoanticorps) ou du complément déposés dans la peau (figure 3). Cet examen a un intérêt dans trois situations :

  • le lupus : détection d’une bande lupique (cf. chapitre 30, « Lupus érythémateux disséminé », item 190 [117]) ;
  • les maladies bulleuses auto-immunes ;
  • les vascularites cutanées pour la détection de complexes immuns dans les parois des capillaires dermiques.
Figure 3 : Principe des examens d’immunofluorescence cutanée directe et indirecte
En immunofluorescence directe, on recherche des autoanticorps déposés dans l’épiderme du malade, par incubation des coupes de peau congelée avec des anticorps couplés à un fluorochrome, spécifiques des isotypes humains (anti-IgA, IgG et IgM). En immunofluorescence indirecte, les autoanticorps sont cherchés dans le sérum des malades, que l’on incube à des dilutions différentes sur une peau animale. La technique de marquage repose ensuite sur une seconde incubation avec les anticorps anti-Ig humaines, comme pour l’examen en immunofluorescence directe. Cette technique permet ainsi de doser la quantité d’autoanticorps circulants. L’immunofluorescence indirecte n’est pas un examen fait dans les services d’anatomie pathologique.

Technique d’immunofluorescence directe cutanée :

  • réalisation de coupes du tissu congelé (peau) au cryostat appliqué sur une lame ;
  • dépôt sur la coupe d’un anticorps spécifique (anti-IgG ou anti-C3 par exemple) couplé à un fluorochrome (FITC, de couleur verte le plus souvent), puis rinçage éliminant les anticorps qui ne se sont pas fixés sur leur cible ;
  • examen de la lame avec un microscope à fluorescence : visualisation de la fluorescence là où il y a des dépôts d’IgG ou de C3 ;
  • interprétation du résultat : localisation et nature des dépôts.

Le choix d’un immunomarquage fluorescent sur une coupe congelée s’explique par le fait que l’on souhaite marquer une protéine extracellulaire (autoanticorps : immunoglobuline et complément). Il est possible de procéder à des immunomarquages sur coupes de tissus fixés et inclus en paraffine (immunohistochimie classique), mais la sensibilité de cette technique en cas de protéines extracellulaires est bien moindre en raison des nombreux bains (alcool, xylène, etc.) nécessaires à la préparation des blocs de paraffine, conduisant d’une part à une altération des protéines et d’autre part à leur élution, au moins partielle.

Le choix d’une technique de révélation fluorescente tient également à des raisons de sensibilité, les fluorochromes étant plus sensibles et donnant moins de bruit de fond, celui-ci pouvant être particulièrement gênant pour l’interprétation des marquages de protéines extracellulaires.

3/5